大肠杆菌是生物医疗领域中最常用的工程菌之一，以其生长迅速、培育成本低及成熟的基因克隆表达系统等优点而受到青睐。其质粒广泛应用于基因工程，在基因分子克隆、疫苗研发及重组蛋白类药物的生产等多个领域，然而，必须严格控制生物制品中的内毒素残留水平。

### 1. 内毒素简介

内毒素位于革兰氏阴性菌的细胞壁最外层，化学成分为磷脂-多糖-蛋白质复合物，其中主要的毒性成分是脂多糖（LPS）中的类脂A。只有在细菌死亡或用人工方法破坏其细胞时，内毒素才会释放。内毒素通过与宿主细胞表面的Toll样受体结合，直接激活炎症细胞，导致发热及全身炎症反应，可能引发弥散性血管内凝血、休克和多脏器衰竭等严重病症，通常被称为“热原”。内毒素具有极高的生物活性，甚至微量也会引发炎症反应及免疫应答，而且其在60℃条件下加热数小时仍不易被破坏，必须在180℃下加热超过3小时才能完全灭活，常规化学药品对其活性影响不大，只有强酸、强碱或强氧化剂能摧毁其结构。

### 2. 内毒素的检测方法

内毒素可以与特定检测试剂反应，基于这一原理，研发出多种检测方法，包括凝胶法、重组C因子法及动态比浊法等。凝胶法利用鲎试剂中的C因子，这是一种对内毒素敏感的蛋白，能够与内毒素结合并激活，从而启动血凝级联反应。该方法操作简便，无需光学检测仪器，但检测范围有限。随着对鲎的保护以及重组技术的发展，新一代人工合成的重组C因子已开始应用于内毒素检测中。重组C因子被内毒素活化后可以与荧光底物反应生成荧光信号，其强度与内毒素浓度成正比，能有效测定内毒素含量。动态比浊法通过光学仪器检测反应混合物达到预定OD值所需时间及浊度变化速率，为追踪产品质量提供数据支持。

### 3. 内毒素的去除方法

由于内毒素具有明显的危害性，FDA等法规对内毒素控制提出了明确要求。首先，需要从源头消除外源性内毒素污染，确保生物药物研发及生产中直接接触样品的设备、容器、储液袋等均经过严格消毒处理。其次，对于样品中可能存在的内源性内毒素污染，需要从样品制备工艺入手，采用合适的去除方法，例如离子交换层析法、疏水层析法及特异性吸附法等。

离子交换层析法利用目标产物与内毒素在缓冲液中的电荷差异进行去除；阴离子交换层析主要通过改变缓冲液的离子强度，使内毒素分子带负电荷而与带正电荷的配基结合去除，而阳离子交换层析则通过pH调节使带正电的目标蛋白吸附，负电荷的内毒素则流过实现分离。疏水层析法则利用高盐条件使内毒素聚集到大分子复合物，直接去除；或通过在特定盐浓度下使目的蛋白不与填料结合，从而实现分离。特异性吸附法则是将多粘菌素B偶联于层析介质上，通过特异性吸附内毒素，同时确保目标蛋白随流动相流出，收集该流出蛋白。尽管方法的去除效果良好，但可能伴随着一定的蛋白损失。此外，还可利用内毒素在不同水溶液中形成的聚集体大小差异，采用凝胶过滤层析及切向流膜过滤技术进一步去除。

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