细胞冻存是一种在低温条件下保存细胞的方法，其目的是在较长时间内维持细胞的活性和功能。这种技术对于细胞系的长期保存、实验的重复性、基因库的建立，以及细胞治疗的储备等方面至关重要。通过冻存，可以有效减少细胞在传代过程中的遗传变异，防止因污染、环境变化或实验操作失误造成的细胞损失。最佳的冷冻保存时机为细胞处于最佳生长速度时。

冷冻保护剂在细胞冻存中发挥关键作用，常用的冷冻保护剂包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油。这些保护剂主要通过降低溶液的冰点，减少冰晶的形成，从而保护细胞免受冰晶带来的机械损伤。DMSO是一种普遍适用于大多数细胞类型的冷冻保护剂，但有些细胞可能对其敏感，此时可以选择甘油作为替代品。

第一阶段：冷冻保存实验步骤

1. 在冷冻管上标记日期、研究人员姓名、细胞编号、传代数和细胞类型等有用信息。

2. 对于贴壁细胞，先去除细胞培养基，用PBS进行清洗，加入适量的胰蛋白酶覆盖细胞，并在37°C的培养箱中孵育约2分钟（具体时间依据细胞类型而定）。然后，添加等量的培养基终止消化，用移液器轻轻吹打细胞，将贴壁细胞洗下来，并转移到50mL的Falcon管中。

3. 对于悬浮细胞，直接将所需体积的细胞转移到50mL的Falcon管中。

4. 使用血细胞计数器计数细胞以确定其活力，冷冻保存的细胞活力应至少为75%。

5. 室温下以300× g离心5分钟。

6. 准备冷冻培养基（见下表）。

使用前将冷冻培养基均匀混合并加热至37°C。冷冻培养基含有必要的冷冻保护剂，如DMSO，以防止细胞内外冰晶的形成，避免细胞膜和成分的损伤。

7. 除去上清液。

8. 加入冻存培养基至所需细胞密度。对于哺乳动物细胞，该浓度通常为1×10⁶/mL冻存液。细胞在冻存液中室温放置的时间不宜超过10分钟。

9. 将1mL样品分装到冷冻管中，盖紧盖子。

10. 将冷冻管转移至室温的冷冻盒中，再放入-80°C的冰箱。在冷冻盒外周添加适量异丙醇，确保温度以每分钟1°C的速度稳定下降。缓慢的冷冻过程有助于防止细胞内冰晶的形成。

11. 约24小时后，将冷冻管从冷冻盒中取出并转移至液氮中进行长期储存。一般情况下，冷冻细胞可以在液氮中保存数年，理想状态下冷冻细胞不应在-80°C下保存太久（最多一周），应尽快转移至液氮中，因为在-80°C下长期储存可能会影响细胞活力。

第二阶段：解冻冷冻细胞系实验步骤

1. 从液氮储存器中取出冷冻管，迅速放入37°C的水浴中，直至解冻约80%（切勿在室温下解冻）。整个过程应控制在1分钟以内。

2. 使用移液器将冷冻管中的内容物转移到含有约10mL预热培养基的15mL Falcon管中。

3. 以300× g离心5分钟，弃去上清液，用适量培养基重悬细胞沉淀。

4. 将细胞悬液转移到培养容器中，随后移入37°C培养箱中进行培养。

在细胞冻存与解冻过程中，确保操作规范和高效，以保障细胞的活性与功能。此外，欢迎借助尊龙凯时的相关研究资源与技术支持，助力科研工作的顺利进行。