### 大鼠肺泡巨噬细胞NR8383培养指南

#### 一、细胞培养条件

细胞名称：大鼠肺泡巨噬细胞NR8383

生长特性：贴壁与悬浮混合生长

冻存条件：无血清冻存液（货号：C7001）

培养体系：F12K + 20% FBS + 1% P/S

传代方法：首次建议 1:2 传代，2天换液

备注：悬浮细胞需离心收集，贴壁细胞按贴壁方法处理，并用无菌离心管收集培养基以作过渡培养。

#### 二、细胞处理步骤

在收到细胞后，待培养至良好状态后，灌满完全培养液并封好瓶口，这样是运输细胞的最佳方法。收到细胞时，用75%酒精喷洒整个细胞瓶消毒，随后在超净台内进行严格无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3至4小时以稳定细胞状态后再进行处理。显微镜观察细胞生长状况，并对细胞进行不同倍数拍照保存（推荐拍摄40x、100x、200x，各一张）。前三天的照片是重要的售后依据，未提供照片者将默认收到状态良好。

（传代后，建议一瓶用原瓶的完全培养基，另一瓶采用自己配制的完全培养基，以便进行对比培养，换液后需松动瓶盖。）

#### 三、细胞培养步骤

a. 细胞传代：如果细胞汇合度未超过80%，将培养瓶中的完全培养液收集至离心管，保留5ml完全培养基并放入37℃、5% CO2的孵箱中培养；如果细胞密度超过80%，则可进行传代培养：

• 对于贴壁细胞：
• 弃去培养上清，使用不含钙、镁的PBS洗涤细胞1-2次。
• 加入约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，放入37℃培养箱中消化1-2分钟，观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速回到操作台，轻拍培养瓶后加5ml以上的完全培养基终止消化。
• 轻轻吹打细胞以确保完全脱落，吸出悬液并转移至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清液，并加入1-2ml完全培养基重悬。
• 将细胞悬液按1:2的比例进行分瓶传代（例如两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。
• 对于悬浮细胞，根据以下方法进行传代：
• 方法一：收集细胞，1000RPM下离心8-10分钟，弃上清液后补加1-2ml培养液并轻轻混匀，将细胞悬液按1:2比例分到新瓶中，添加8ml完全培养基。
• 方法二：可选择半数换液，弃去半数培养基后将剩余细胞悬起，按1:2比例分到新瓶中并添加8ml完全培养基。

b. 细胞冻存：

• 当细胞生长覆盖培养瓶的80%时，弃去T25培养瓶中的培养液，使用PBS洗涤细胞一次；
• 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞回缩变圆后加入5ml完全培养基终止消化，再轻轻吹打以使细胞脱落，随后将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟；
• 弃去上清液，沉淀细胞，加入1ml的尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管；
• 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，如后期需转入液氮罐，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上再转入液氮罐中。

c. 细胞复苏：

• 从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护面具），快速将其置入37℃水浴中解冻，直到冻存管内无结晶后，用75%的酒精擦拭外壁；
• 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，进行1000RPM离心5分钟；
• 弃去上清液，以5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶中，放在37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养；第二天更换为新鲜的完全培养基。

#### 四、注意事项

部分细胞可能在运输过程中脱落，这是正常现象。如脱落较多，请将培养瓶中的培养液收集至离心管，1000RPM离心5分钟，收集上清以作过渡培养；沉淀部分加入胰酶1-2ml并轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后再加5ml完全培养基终止反应。再次离心后弃去上清，加1-2ml完全培养基重悬，并按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新鲜完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

#### 五、售后条款

1）细胞出现问题，重发情况包括：运输过程中细胞丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等；细胞污染问题需在收到产品48小时内反馈真实实验结果；常温发货细胞静置24小时或干冰发货细胞复苏24小时后大部分细胞未存活等情况均可重发。

2）细胞出现问题不予重发的情况包括：客户造成的细胞污染；因客户不当操作导致的细胞状态不佳；非本库推荐培养体系导致的细胞状态不佳等情况。

通过严格遵循上述步骤与注意事项，您能够确保尊龙凯时大鼠肺泡巨噬细胞NR8383的成功培养与实验的顺利进行。